实时浮游菌监测仪器已问世超过十年。这些仪器能够克服传统基于培养的浮游菌监测方法所面临的诸多障碍，例如某些微生物的回收率低、培养时间长以及在干预过程中污染产品的风险。然而，部分由于对这些仪器所用技术缺乏了解，其实施至今仍受到限制。本文旨在简要介绍这项技术及实时检测浮游菌的原理。
激光诱导荧光技术（Laser Induced Fluorescence）
实时浮游菌监测技术背后的核心是激光诱导荧光技术（LIF），也称为增强的浮游菌计数或自发荧光浮游菌计数。该技术的核心在于检测粒子通过激光束时对激光的影响。与传统的微生物学方法相比，这种方法更类似于光学粒子计数。
光学粒子计数基础
光学粒子计数已在洁净室中广泛应用数十年，用于测定空气中粒子的浓度和粒径分布。粒子被采样并引导通过光学仓，在仓中通过激光束时，光会发生散射。根据采样空气的体积对光散射事件进行计数，并通过测量每个事件的强度来测定每个粒子的粒径。光学粒子计数器利用这些数据计算并报告空气中粒子的浓度和粒径分布。
使用激光诱导荧光进行浮游菌计数
与光学粒子计数器类似，使用 LIF 技术的仪器也会让粒子通过激光束并检测散射光。然而，与光学粒子计数器不同的是，LIF 仪器还会检测粒子是否发光。如果粒子吸收部分光并以更高波长重新发射光，就会发生荧光现象，如图 1 所示。荧光是判断粒子是否为浮游菌的良好指标，因为活体微生物含有相对较高浓度的荧光分子。由于该方法依赖光学特性而非培养条件（如培养基类型、培养温度、培养时间等），它通常比基于培养的方法检测到更多的浮游菌，提供了更灵敏的浮游菌污染测量结果。
图 1. 浮游菌和非浮游菌光学特性的简化示意图
结果的可靠性
遗憾的是，微生物并非唯一会发光的粒子。早期的 LIF 仪器误报率非常高，因为它们难以区分携带微生物的粒子和其它发光粒子。这些仪器仅基于两个光学参数（光散射和单一波长范围内的荧光）来判断活性。如图 2 A 所示，非浮游菌发光粒子（例如花粉）很难与浮游菌区分开来。为了可靠地区分两者，需要更多信息。这推动了能够检测第二个波长范围内荧光仪器的发展。例如，TSI BioTrak® 实时浮游菌计数器可在 430-500 nm 和 500-650 nm 的波长范围内检测荧光。如图 2 B 所示，这大大提高了区分浮游菌和非浮游菌发光粒子的能力。这种改进使仪器适用于无菌区域的测量，在这些区域中检测到单个浮游菌污染物可能需要进行调查，甚至可能导致产品损失。
图 2. 使用三个光学参数改进浮游菌区分能力
总结
激光诱导荧光技术（Laser Induced Fluorescence） 利用微生物的荧光特性来测量采样空气中浮游菌的浓度。测量结果以与光学粒子计数器报告总粒子计数相似的方式实时显示。多年来技术的改进使得这些仪器适用于包括无菌区域在内的各种级别的洁净室。在这些区域，仪器具有的更高灵敏度和实时测量结果的优势可以更好地确保生产产品的质量。